Пиросеквенирование — это метод секвенирования ДНК (определение последовательности нуклеотидов в молекуле ДНК), основанный на принципе «секвенирование путем синтеза».
Метод «секвенирования путем синтеза» позволяет секвенировать одну цепь ДНК путем синтеза комплементарной цепи, при этом регистрируется присоединение каждого нуклеотида. В ходе реакции матрица ДНК иммобилизована, растворы нуклеотидов A, C, G и T добавляются и отмываются последовательно после каждого цикла секвенирования.
Метод пиросеквенирования основан на детекции активности фермента ДНК-полимеразы с другим хемилюминесцентным ферментом. Последовательность подачи реагентов в реакционную смесь, которые дают хемилюминесцентный сигнал, позволяет определить последовательность анализируемого участка ДНК.
Последовательность реакций пиросеквенирования
В реакции пиросеквенирования участвуют четыре фермента. Схема и основные этапы реакции представлены на рис. 1.
Схема реакции пиросеквенирования.jpg
Рисунок 1. Схема реакции пиросеквенирования. 
Пиросеквенирование включает в себя следующие этапы:
Этап 1
Амплификация фрагмента ДНК и биотинилирование цепи, которая послужит матрицей для пиросеквенирования. Денатурация биотинилированного одноцепочечного ПЦР-ампликона, его изоляция и гибридизация с праймером для секвенирования.
Этап 2
Инкубация праймера и одноцепочечной матрицы в присутствии ДНК-полимеразы, АТФ-сульфурилазы, люциферазы, апиразы, и субстратов: аденозин – 5’- фосфосульфата (APS) и люциферина.
Этап 3
Добавление первого дезоксирибонуклеотид трифосфата (dNTP) в реакцию. ДНК-полимераза катализирует добавление dNTP к праймеру для секвенирования, если он комплементарен к последовательности матрицы ДНК. Каждое присоединение к цепи сопровождается выделением пирофосфата (PPi) в количестве, эквимолярном количеству встроившихся нуклеотидов.
Этап 4
АТФ-сульфурилаза превращает пирофосфат в АТФ в присутствии аденозин-5’-фосфосульфата. Образовавшаяся АТФ запускает люциферазо-опосредованную реакцию окисления люциферина в оксилюциферин, в результате чего происходит образование видимого света в количестве, пропорциональном количеству АТФ. Свет детектируется CCD-камерой и отображается на пирограмме в виде пиков. Высота пиков пропорциональна количеству нуклеотидов, встроившихся в матрицу.
Этап 5
В течение всей реакции фермент апираза деградирует невстроившиеся нуклеотиды и избыток АТФ. После завершения деградации нуклеотидов, не встроившихся в цепь ДНК, добавляется новый нуклеотид.
Этап 6
Добавление нуклеотидов осуществляется последовательно. Следует отметить, что дезоксиаденозин-альфа-тио-фосфат используется в роли заместителя дезоксиаденозин-3-фосфата (дАТФ), так как он эффективно распознается ДНК-полимеразой, но не распознается люциферазой. В течение реакции комплементарная цепь ДНК достраивается, и последовательность нуклеотидов определяется согласно пикам на пирограмме.
Пиросеквенаторы PyroMark (QIAGEN)
Объединяя секвенирование и количественную оценку генетических изменений в одной мощной системе, приборы серии PyroMark превосходят все другие системы секвенирования при целевом анализе небольших фрагментов ДНК. Это, в свою очередь, приводит к уменьшению временных и денежных вложений при использовании PyroMark в разнообразных областях применения.
Отличительные преимущества пиросеквенирования PyroMark:
Секвенирование de novo коротких фрагментов ДНК (до 180 п.о.)
Ресеквенирование любого участка генома человека, модельных объектов, микроорганизмов или вирусов
Количественный анализ частот аллельной встречаемости
Мутационный анализ: идентификация точечных однонуклеотидных замен, вставок и делеций
Количественный анализ метилирования ДНК. Анализ метилирования может быть совмещен с SNP типированием
Верификация и валидация результатов полногеномного анализа
На сегодняшний день линейка секвенаторов PyroMark представлена следующими моделями:
(с) [url=http://www.liveinternet.ru/users/5967931/post379396753/
]ИнтерЛабСервис[/url]
